Relevancia del macrófago como fuente de ligandos WNT en las complicaciones asociadas a la enfermedad de crohn

La fibrosis y las fistulas son complicaciones frecuentes de la enfermedad de Crohn cuya etiopatogenia es desconocida. La cronicidad de la inflamación junto con alteraciones en la reparación tisular tras un daño, se han relacionado con estas complicaciones. Los macrófagos son células del sistema inmunitario innato ampliamente implicadas en la regulación de ambos procesos y como consecuencia en el desarrollo de la fibrosis. Estas células presentan elevada plasticidad y un continuo espectro de fenotipos funcionales que explican la diversidad de funciones que regulan. Recientes estudios han demostrado que los macrófagos, a través de vías de señalización dependientes de Stat6, actúan como fuentes de ligandos Wnt y participan en los mecanismos de regeneración mucosa en la colitis murina aguda. El objetivo de la presente tesis doctoral es analizar la relevancia del macrófago como fuente de ligandos Wnt en el desarrollo de fibrosis intestinal y fístulas. Para ello hemos utilizado un modelo murino de colitis crónica y resecciones intestinales de pacientes con enfermedad de Crohn con un patrón clínico estenosante y penetrante. Nuestros resultados muestran que la administración intrarectal semanal de TNBS induce una colitis crónica que provoca una respuesta fibrogénica en ratones Stat6 -/-, pero no en animales silvestres. Esta fibrosis se asocia con una baja proporción de macrófagos CD206 positivos, y con la acumulación de macrófagos CD16 positivos que producen Wnt6. Además, la transferencia de macrófagos silvestres tratados con IL4 a ratones Stat6-/- reduce el número de macrófagos positivos para CD16 y la fibrosis intestinal. La acumulación de macrófagos CD16 positivos es también detectada en el tejido intestinal que rodea el tracto de la fistula en pacientes con EC penetrante y no en el tejido fibrótico de pacientes con EC estenosante. En ambos casos se detecta acumulación de colágeno y expresión de marcadores de transición epitelial-mesenquimal, pero la colocalización de E-CADHERINA y VIMENTINA es mayor en el tejido intestinal de pacientes con patrón penetrante. Este tejido presenta una mayor expresión génica y proteica de FZD4 y de WNT2B, así como un elevado número de macrófagos CD16/WNT2B positivos. Además, la inmunoprecipitación de FZD4 permite detectar una mayor expresión de WNT2B unido a este receptor en el tejido intestinal que rodea la fístula. Por último, en células aisladas, WNT2B induce transición epitelial-mesenquimal a través de la activación de FZD4 lo que sugiere que la interacción WNT2B/FZD4 puede estar involucrada en la patogénesis de la fístula y apunta a una nueva diana farmacológica para prevenir las complicaciones de la EC.Fibrosis and fistulas are frequent complications of Crohn's disease whose etiopathogenesis is unknown. The chronicity of inflammation ant the alterations in tissue repair after damage have been related to these complications. Macrophages are cells of the innate immune system widely involved in the regulation of both processes and as a consequence, in the development of fibrosis. These cells have high plasticity and a continuous spectrum of functional phenotypes that explain the diversity of functions they regulate. Recent studies have shown that macrophages, through Stat6-dependent signaling pathways, act as source of Wnt ligands and participate in the mechanisms of mucosal regeneration in acute murine colitis. The aim of the present doctoral thesis is to analyze the relevance of the macrophage as a source of Wnt ligands in the development of intestinal fibrosis and fistulas. For this purpose, we have used a murine model of chronic colitis and intestinal resections of patients with Crohn's disease with a stenosing and penetrating clinical pattern. Our results show that the weekly intrarectal administration of TNBS induces a chronic colitis that causes a fibrogenic response in Stat6 - / - mice, but not in wild type animals. This fibrosis is associated with a low proportion of positive CD206 macrophages, and with the accumulation of CD16 positive macrophages that produce Wnt6. In addition, the transfer of wild macrophages treated with IL4 to Stat6 - / - mice reduces the number of macrophages positive for CD16 and intestinal fibrosis. The accumulation of CD16 positive macrophages is also detected in the intestinal tissue surrounding the fistula tract in patients with penetrating CD and not in the fibrotic tissue of patients with stenosing CD. In both cases, accumulation of collagen and expression of epithelial-mesenchymal transition markers is detected, but the colocalization of E-CADHERIN and VIMENTIN is greater in the intestinal tissue of patients with a penetrating pattern. This tissue has a higher gene and protein expression of FZD4 and WNT2B, as well as a high number of positive CD16 / WNT2B macrophages. In addition, the immunoprecipitation of FZD4 allows to detect a higher expression of WNT2B bound to this receptor in the intestinal tissue surrounding the fistula. Finally, in isolated cells, WNT2B induces epithelial-mesenchymal transition through the activation of FZD4, which suggests that the WNT2B / FZD4 interaction may be involved in the pathogenesis of the fistula and points to a new pharmacological target to prevent the complications of the EC

Supplementation effects of whey proteins in lymphocytes of Wistar rats

Orientador: Celio Kenji MiyasakaDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de AlimentosResumo: As proteínas presentes no soro de leite têm demonstrado um grande número de efeitos benéficos, como atividade anticarcinogênicas, efeito antiulcerogênica e função imunoestimulatória. Esta propriedade imunoestimulatória está sendo relacionada à possível manipulação da glutationa intracelular. Os linfócitos são importantes células do sistema de defesa celular e humoral. Este trabalho teve como objetivo estudar os efeitos da suplementação com soro de leite sobre os linfócitos de ratos Wistar. Cento e vinte animais foram divididos em 4 grupos (n = 30), sendo um grupo controle (C) e os demais suplementados com caseinato de cálcio (K), isolado protéico de soro de leite (I) e hidrolisado protéico de soro de leite (H). Os ratos foram mantidos em gaiolas individuais com água e ração à vontade. Aos 18 dias de suplementação amostras de sangue foram recolhidas para realização de hemograma. Dez dias depois, os animais foram sacrificados e os linfócitos mesentéricos retirados, contados em câmara de Neubauer e incubados (5x107células/ml) em presença de peróxido de hidrogênio. A viabilidade celular foi avaliada antes e depois da incubação. Também foram avaliadas as atividades enzimáticas da glutationa redutase (GSH-Red) e da glutationa peroxidase (GSH-Px). Apesar de um maior consumo de ração, os animais do grupo C não foram os que apresentaram maior ganho de peso. Estatisticamente, seu ganho de peso foi maior que o do grupo K, menor que do grupo I e não diferiu significantemente do grupo H. Os animais do grupo H apresentaram número de linfócitos 134% maior quando comparado aos grupos I e K e 158% mais elevado em relação ao grupo C. Na análise de sangue o número de linfócitos (x10³ celulas/mL) dos animais dos grupos H e I foram estatisticamente maiores que os demais grupos. Os linfócitos dos animais do grupo H tiveram a sua viabilidade diminuída apenas 4,08% após incubação com peróxido de hidrogênio enquanto que no grupo C a diminuição de viabilidade foi de 28,9%. A enzima GSH-Red dos animais do grupo H (38,22 pmols . min-1. mg proteina-1) se mostrou maior que dos animais do grupo C (17,64 pmols . min-1. mg proteina-1). Não houve diferenças entre os grupos na determinação de GSH-Px. Assim, verificou-se a qualidade nutricional atribuída ao soro de leite e que este pode interferir no metabolismo de linfócitosAbstract: The whey proteins have demonstrated some beneficial effects, as anticarcinogenic activity, antiulcerogenic effect and immunostimulanting function. These immunostimulanting properties have being related to the possible manipulation of intracellular glutathione. The lymphocytes are important cells of the cellular and humoral defense system. The aim of this work was to study the effect of the whey proteins supplementation on lymphocytes of Wistar rats. One hundred and twenty animals were randomly distributed in 4 groups (n = 30): one control group (C) while the others were supplemented with calcium caseinate (K), whey protein isolated (I) and whey protein hydrolysate (H). The rats were maintained in individual cages with water and ration ad libitum. After 18 days of supplementation, blood samples were collected for hemogram accomplishment. Ten days later, the animals were killed and the mesenteric lymphocytes were counted in Neubauer¿s camara and incubated (5x107células/ml) in the presence of hydrogen peroxide. The cellular viability was evaluated before and after the incubation. The enzymatic activities of glutathione reductase (GSH-Red) and of glutathione peroxidase (GSH-Px) were also evaluated. Animals of group C had the highest feed consumption, although its body weight gain was the same as group H, greater than group K and lesser than group I. The group H animals have presented number of lymphocytes 134% greater when compared with groups I and K and 158% more than group C animals. The blood analysis have shown that the number of lymphocytes (x103 cells/mL) of group H animals were bigger than the others groupsMestradoNutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de AlimentosMestre em Alimentos e Nutriçã

Preparação de um sistema de libertação controlada e localizada de um antibiótico de largo espectro para aplicação em cirurgias ortopédicas reconstrutivas

O propósito principal deste trabalho foi a produção de um sistema de libertação controlada e localizada, recorrendo-se a matriz óssea bovina para a obtenção de um enxerto ósseo com propriedades antibacterianas a ser aplicado em cirurgias ortopédicas reconstrutivas. Com este objectivo em mente, dividiu-se o plano de trabalhos em três áreas distintas. Primeiramente procedeu-se à criação de um filme de gelatina, utilizando para o efeito gelatina de tipo A, produzida a partir de pele de porco. O filme foi então reticulado utilizando diferentes razões molares de carbodiimida EDC para número de grupos carboxílicos presentes na gelatina. Depois de reticuladas, as amostras de gelatina foram sujeitas a ensaios de absorção de água e de degradação. Os primeiros mostraram que o rácio de absorção de PBS por grama de filme diminui com o aumento do grau de reticulação, tal como era esperado. Os testes de degradação denotam um aumento da resistência à degradação à medida que aumenta o grau de reticulação. Além destas características, os filmes de gelatina apresentam ainda uma boa aderência ao osso, mantendo-se o revestimento durante vários dias quando a placa de osso revestida se encontra imersa em solução. O segundo componente necessário para a criação do sistema de libertação proposto foi a microencapsulação. Utilizaram-se, essencialmente, três métodos de microencapsulação pelo método de extracção/evaporação do solvente para encapsular a Ceftriaxona, fármaco utilizado neste estudo. - Dupla emulsão água/óleo/água (W/O/W); - Dupla emulsão água/óleo/óleo (W/O/O); - Dupla emulsão sólido/óleo/óleo (S/O/O). O método da dupla emulsão água/óleo/água foi o que apresentou melhores resultados práticos nos testes de libertação in vitro, sendo este o caso em que a libertação se processou de forma mais gradual. Também a média de valores da eficiência de encapsulação na totalidade das amostras foi superior neste caso. Ainda assim, as formulações necessitam de ser optimizadas, de modo a diminuir a libertação inicial de fármaco, que se processa de uma forma excessivamente rápida quando comparada com o perfil de libertação ideal. Em todos os casos se obtiveram percentagens de libertação de massa de fármaco de aproximadamente VIII 70% nas primeiras horas, sendo o objectivo a obtenção de um sistema que liberte o antibiótico gradualmente ao longo de cerca de 6 semanas. O terceiro passo do processo foi a combinação dos componentes descritos anteriormente para obter um sistema de libertação controlada, tendo estes sido combinados de três formas diferentes com o objectivo de verificar qual o melhor sistema de libertação, realizando ao mesmo tempo comparações entre eles, por forma a verificar qual a contribuição de cada componente para o sistema de libertação controlada e localizada proposto como objectivo principal deste trabalho. Os sistemas estudados foram os seguintes. - Placas de osso revestidas por filmes de gelatina com impregnação em solução de Ceftriaxona; - Placas de osso revestidas por filmes de gelatina com adição de micropartículas; - Placas de osso revestidas por gelatina com adição de micropartículas e impregnação em solução de CFX. Para todos os sistemas foram realizados ensaios de libertação in vitro. Em todas os casos se observou a mesma libertação inicial excessivamente elevada, acompanhada do final de libertação de fármaco ao fim de apenas alguns dias. Há, portanto, necessidade de optimização dos sistemas de libertação estudados, de modo a ser possível obter um sistema com um perfil de libertação ideal, com libertação de fármaco inicial a rondar os 50%, seguida de uma libertação gradual ao longo de, aproximadamente, 6 semanas. No entanto, os resultados obtidos permitem a criação de bases científicas que poderão ser aproveitadas em trabalhos futuros

O papel da maresina 1, um mediador lipídico derivado do ácido graxo poliinsaturado omega-3, na colite experimental em camundongos

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2013Os óleos de peixe, bem como alguns vegetais apresentam quantidades significantes de ácidos graxos poliinsaturados ômega-3, sendo que os principais encontrados em derivados marinhos são: o ácido graxo eicosapentaenóico (EPA) e o ácido graxo docosahexaenóico (DHA). Estudos prévios têm demonstrado que uma dieta rica em óleo de peixe pode exercer efeitos benéficos sobre inúmeras doenças com características inflamatórias, dentre as quais se destacam as doenças inflamatórias intestinais (IBD). Um novo mediador lipídico derivado do DHA, denominado maresina 1 (MaR1) têm apresentado potente atividade analgésica, antiinflamatória e pró-resolutiva em distintos modelos experimentais de inflamação, sendo assim, foi hipotetizado que o processo de resolução desencadeado pela MaR1 também poderia prevenir ou atenuar a inflamação intestinal em camundongos. Dessa forma, o presente estudo buscou avaliar o papel da MaR1, no modelo de colite aguda induzida pelo sulfato sódico de dextrana (DSS) (com um ou dois ciclos de DSS), e no modelo de colite aguda induzido pelo ácido trinitrobenzenosulfônico (TNBS) em camundongos. Os resultados observados demonstraram que o tratamento sistêmico com a MaR1 reduziu o escore clínico experimental e o dano tecidual colônico nos modelos de colite induzida pelo DSS (tanto no primeiro quanto no segundo ciclo), bem como na colite aguda induzida pelo TNBS. O efeito benéfico da MaR1 parece estar associado com sua habilidade em reduzir a liberaçaõ das citocinas: interleucina (IL)-1?, factor de necrose tumoral (TNF)-?, IL-6 e interferon (IFN)-? no modelo agudo com um único ciclo com DSS, e IL-1? e IL-6, mas não TNF-? e IFN-? no modelo agudo com dois ciclos com DSS, além da inibição da expressão da molécula de adesão ICAM-1, e de proteínas relacionadas ao inflamassoma, como o NALP3 e a pró-caspase-1, e pela ação sobre a ativação do fator nuclear ?B (NF-?B). Adicionalmente, através de experimentos in vitro, evidenciou-se que a MaR1 reduziu a liberação de IL-1?, TNF-?, IL-6 e IFN-? provenientes de macrófagos, e parece induzir a polarização de macrófagos para o fenótipo antiinflamatório M2. Em conclusão, o conjunto dos resultados contribui para estender os conhecimentos acerca dos mecanismos de ação antiinflamatório e pró-resolutivos da MaR1 e sugere uma nova abordagem terapêutica para o tratamento das IBD

Alimentos funcionales: Leches fermentadas con bacterias ácido lácticas productoras de exopolisacárido con propiedades antiinflamatorias en el tracto gastrointestinal

El desarrollo de nuevos alimentos funcionales se ha convertido en una de las áreas de investigación e innovación de mayor interés para la industria alimentaria. Dentro de los alimentos funcionales, se destacan las leches fermentadas con microorganismos probióticos cuyo consumo ha sido asociado con diversos efectos beneficiosos sobre la salud. En el presente trabajo se analizó la potencialidad probiótica de tres cepas L. paracasei productoras de exopolisacárido aisladas de kefir para la obtención de leches fermentadas funcionales. L. paracasei CIDCA 8339 y CIDCA 83124 presentaron propiedades tecnológicas y probióticas adecuadas para ser utilizadas como starters. Las leches fermentadas con estas cepas modulan la respuesta inflamatoria a nivel gástrico e intestinal siendo el lactato el principal metabolito responsable del efecto. Además, los exopolisacáridos producidos en leche pueden modificar la microbiota fecal y el perfil de ácidos grasos de cadena corta contribuyendo a reducir el estado inflamatorio. Los resultados obtenidos permiten proponer a las cepas CIDCA 8339 y CIDCA 83124 como nuevos candidatos para la obtención de leches fermentadas con propiedades antiinflamatorias para aliviar la sintomatología en personas que sufren de gastritis o enfermedades inflamatorias intestinales.Facultad de Ciencias Exacta

Employment of cell therapy in experimental model of inflammatory bowel disease.

Pretendeu-se, no presente estudo, verificar a segurança e a eficácia do transplante de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASC) em ratos com UC induzida por ácido trinitrobenzenosulfonico (TNBS). A população celular foi isolada do tecido adiposo por dissociação mecânica e cultivada. O comportamento celular foi verificado por meio da morfologia, proliferação, viabilidade, capacidade de aderência à superfície plástica e parâmetros de diferenciação osteogênica, condrogênica e adipogênica. Os animais foram avaliados, considerando-se os aspectos clínicos, macroscópicos, microscópicos e bioquímicos. No modelo experimental de UC, a infusão de ASC reduziu significativamente a presença de aderências entre o cólon e órgãos adjacentes, bem como diminuiu a quantidade de células inflamatórias na mucosa lesada. Conclui-se que as ASC podem promover e/ou acelerar o processo de regeneração da mucosa intestinal inflamada e assim, serem empregadas como uma opção terapêutica com amplo potencial de aplicabilidade no tratamento da DII.It was intended in this study verify the safety and efficacy of the transplantation of adipose derived stem cells (ASC) in rats with ulcerative colitis induced by trinitrobenzenosulfonico acid (TNBS). The cell population was isolated from the adipose tissue by mechanical dissociation and cultured. The cell behavior was verified by the morphology, proliferation, viability, ability to adhere to the plastic surface and parameters of osteogenic differentiation, adipogenic and chondrogenic. The animals were evaluated, considering the aspects clinical, macroscopic, microscopic and biochemical. In experimental ulcerative colitis, infusion of ASC significantly reduced the presence of adhesions between the colon and adjacent organs and decreased the amount of inflammatory cells in the injured mucosa. It is concluded that the ASC can promote and/or accelerate the healing process of the intestinal mucosa inflamed and thus be employed as a therapeutic option with wide potential application in the treatment of IBD

Terapia celular em modelo experimental de doença inflamatória intestinal

Inflammatory bowel disease, which mainly involves Crohn's disease and ulcerative rectocolitis, is an inflammatory condition of the mucosa that can afflict any segment of the gastrointestinal tract. Despite the fact that the existing therapies result in improvement in patient's symptomatology and quality of life, there is no curative treatment. Surgical treatment involves complex procedures associated with high morbidity and mortality rates. In this context, cell therapy with stem cells has emerged as a treatment with broad potential applicability. In this study, we intended to verify the efficacy of transplantation of adipose tissue-derived stem cells in rats with intestinal inflammation induced by trinitrobenzenesulfonic acid. The cell population was isolated from the adipose tissue of inguinal region of rats and processed for culture by mechanical dissociation. The animals were evaluated with respect to clinical and biochemical aspects, as well as by macroscopic, microscopic and histological analyses. In the experimental model of bowel inflammation by 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, the infusion of adipose tissue significantly reduced the presence of adhesions in the colon and adjacent organs and decreased the activity of myeloperoxidase, a marker of neutrophil infiltration in the injured mucosa. The results suggest that cell therapy with adipose tissue can promote and/or accelerate the regeneration of damaged intestinal mucosa. It is concluded that the presence of adhesions and the determination of myeloperoxidase activity provide indications that adipose tissue can promote and/or accelerate the regeneration of inflammatory bowel mucosa.A Doença Inflamatória Intestinal (DII), consistindo principalmente da doença de Crohn e retocolite ulcerativa, é uma condição inflamatória da mucosa que pode acometer qualquer segmento do trato gastrointestinal. Apesar das terapias existentes resultarem na melhora dos sintomas e da qualidade de vida dos pacientes, não há nenhum tratamento curativo. O tratamento cirúrgico envolve procedimentos complexos associados a altas taxas de morbimortalidade. Neste contexto, a terapia celular com células-tronco desponta como opção de tratamento potencialmente promissora. Em função destes aspectos, pretendeu-se, no presente estudo, verificar a eficácia do transplante de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASC) em ratos com inflamação intestinal induzida por ácido trinitrobenzenosulfonico (TNBS). As ASCs foram obtidas por dissociação mecânica do tecido adiposo da região inguinal de ratos e processadas para cultivo. Os animais foram avaliados, considerando-se os aspectos clínicos e bioquímicos, além de análises macroscópica, microscópica e histológica. No modelo de inflamação intestinal induzida por TNBS, a infusão de ASCs reduziu significativamente a presença de aderências entre o cólon e órgãos adjacentes, bem como diminuiu a atividade da mieloperoxidase (MPO), um marcador da infiltração de neutrófilos na mucosa lesada. Os resultados obtidos permitem concluir que a terapia celular com ASCs pode promover e/ou acelerar o processo de regeneração da mucosa intestinal inflamada